Bakterie Escherichia coli je jedním z nejvíce preferovaných organismů pro produkci rekombinantních proteinů. E. coli je velmi dobře zavedeným hostitelem, který nabízí snadnou genetickou manipulaci, krátkou dobu kultivace, schopnost kontinuální fermentace a cenově dostupná kultivační media. Pro dosažení vysoké úrovně proteinové exprese, a tedy vysoké produkce rekombinantního proteinu je třeba provádět optimalizace kultivačních podmínek. Právě na optimalizaci kultivace se zaměřuje tato diplomová práce, kde praktická část je zaměřena na produkované enzymy uridin fosforylázu (UP) a purin nukleosid fosforylázu (PNP).
Bakterie E. coli produkující UP nebo PNP byly kultivovány na šesti mediích s různými zdroji živin. Produkce proteinů byla ověřena na spektrofotometru metodou dle Bradfordové a dále pomocí polyakrylamidové gelové elektroforézy s SDS (SDS-PAGE). Aktivita enzymů byla měřena HPLC analýzou. Dále byla u všech vzorků stanovena sušina.
Na základě výsledků z těchto analýz bylo vybráno medium Terrific Broth s přídavkem glukózy po 4 hodinách kultivace (TBG4), které bylo následně použito pro upscaling do fermentoru. Úspěšná kultivace ve fermentoru potvrdila výsledky kultivace v Erlenmeyerových baňkách.
Anotace v angličtině
Escherichia coli is one of the most preferred organisms to produce recombinant proteins. E. coli is a well-established host that offers ease of genetic manipulation, short culture times, continuous fermentation capability and affordable culture media. To achieve high levels of protein expression, and therefore high recombinant protein production, optimization of culture conditions is required. This thesis is focused on the optimization of cultivation, the practical part is focused on the production of Uridine Phosphorylase (UP) and Purine Nucleoside Phosphorylase (PNP) enzymes.
E. coli bacteria producing UP or PNP were cultured on six media with different nutrient sources. Protein production was verified on a spectrophotometer by the Bradford assay and further by polyacrylamide gel electrophoresis with SDS (SDS-PAGE). Enzyme activity was measured by HPLC assay. In addition, the dry weight biomass was determined for all samples.
Based on results from these assays, Terrific Broth medium with glucose addition after 4 h of cultivation (TBG4) was selected and subsequently used for upscaling to the fermenter. Successful cultivation in the fermenter confirmed the results of cultivation in Erlenmeyer flasks.
Klíčová slova
Escherichia coli, rekombinantní proteiny, kultivace, upscaling, produkce rekombi-nantních proteinů
Klíčová slova v angličtině
Escherichia coli, recombinant proteins, cultivation, upscaling, recombinant protein production
Rozsah průvodní práce
82 s. (134 607)
Jazyk
CZ
Anotace
Bakterie Escherichia coli je jedním z nejvíce preferovaných organismů pro produkci rekombinantních proteinů. E. coli je velmi dobře zavedeným hostitelem, který nabízí snadnou genetickou manipulaci, krátkou dobu kultivace, schopnost kontinuální fermentace a cenově dostupná kultivační media. Pro dosažení vysoké úrovně proteinové exprese, a tedy vysoké produkce rekombinantního proteinu je třeba provádět optimalizace kultivačních podmínek. Právě na optimalizaci kultivace se zaměřuje tato diplomová práce, kde praktická část je zaměřena na produkované enzymy uridin fosforylázu (UP) a purin nukleosid fosforylázu (PNP).
Bakterie E. coli produkující UP nebo PNP byly kultivovány na šesti mediích s různými zdroji živin. Produkce proteinů byla ověřena na spektrofotometru metodou dle Bradfordové a dále pomocí polyakrylamidové gelové elektroforézy s SDS (SDS-PAGE). Aktivita enzymů byla měřena HPLC analýzou. Dále byla u všech vzorků stanovena sušina.
Na základě výsledků z těchto analýz bylo vybráno medium Terrific Broth s přídavkem glukózy po 4 hodinách kultivace (TBG4), které bylo následně použito pro upscaling do fermentoru. Úspěšná kultivace ve fermentoru potvrdila výsledky kultivace v Erlenmeyerových baňkách.
Anotace v angličtině
Escherichia coli is one of the most preferred organisms to produce recombinant proteins. E. coli is a well-established host that offers ease of genetic manipulation, short culture times, continuous fermentation capability and affordable culture media. To achieve high levels of protein expression, and therefore high recombinant protein production, optimization of culture conditions is required. This thesis is focused on the optimization of cultivation, the practical part is focused on the production of Uridine Phosphorylase (UP) and Purine Nucleoside Phosphorylase (PNP) enzymes.
E. coli bacteria producing UP or PNP were cultured on six media with different nutrient sources. Protein production was verified on a spectrophotometer by the Bradford assay and further by polyacrylamide gel electrophoresis with SDS (SDS-PAGE). Enzyme activity was measured by HPLC assay. In addition, the dry weight biomass was determined for all samples.
Based on results from these assays, Terrific Broth medium with glucose addition after 4 h of cultivation (TBG4) was selected and subsequently used for upscaling to the fermenter. Successful cultivation in the fermenter confirmed the results of cultivation in Erlenmeyer flasks.
Klíčová slova
Escherichia coli, rekombinantní proteiny, kultivace, upscaling, produkce rekombi-nantních proteinů
Klíčová slova v angličtině
Escherichia coli, recombinant proteins, cultivation, upscaling, recombinant protein production
Zásady pro vypracování
Cílem diplomové práce je optimalizace kultivačních podmínek za cílem zvýšení produkce rekombinantních proteinů syntetizovaných vybranými kmeny E.coli. V experimentální části bude hodnocen vliv složení
kultivačního média a podmínek kultivace na produkci rekombinantních proteinů za účelem uspcalingu kultivačního procesu.
Literární přehled bude zpracován na téma kultivace E.coli, produkce rekombinantních proteinů a otpimalizace kultivačních podmínek.
Metodika - popis použitých kmenů E.coli a produkovaných enzymů, metod kultivace, použitých mikrobiálních a analytických technik.
Výsledky - popis dosažených výsledků, uspořádání do tabulek a grafů.
Diskuse - porovnání zjištěných údajů s literárními zdroji.
Závěr - závěr plynoucí ze zjištěných výsledků.
Seznam použité literatury.
Zásady pro vypracování
Cílem diplomové práce je optimalizace kultivačních podmínek za cílem zvýšení produkce rekombinantních proteinů syntetizovaných vybranými kmeny E.coli. V experimentální části bude hodnocen vliv složení
kultivačního média a podmínek kultivace na produkci rekombinantních proteinů za účelem uspcalingu kultivačního procesu.
Literární přehled bude zpracován na téma kultivace E.coli, produkce rekombinantních proteinů a otpimalizace kultivačních podmínek.
Metodika - popis použitých kmenů E.coli a produkovaných enzymů, metod kultivace, použitých mikrobiálních a analytických technik.
Výsledky - popis dosažených výsledků, uspořádání do tabulek a grafů.
Diskuse - porovnání zjištěných údajů s literárními zdroji.
Závěr - závěr plynoucí ze zjištěných výsledků.
Seznam použité literatury.
Seznam doporučené literatury
Klouda, Pavel: Moderní analytické metody. 2., upr. a dopl. vyd. Ostrava. Pavel Klouda, 2003, ISBN 80-86369-07-2
Hortsch, Ralf a Dirk Weuster-Botz. Growth and recombinant protein expression with Escherichia coli in different batch cultivation media. Applied Microbiology and Biotechnology. 2011, 90(1)m 69-76. DOI:10.1007/s00253-0103036-V
Papaneophytou, Christos P. a George Kontopidis. Statistical sppiroaches to maximize recombinant, protein expression in Escherichia coli. A general review. Protein Expression and Purification.
2014, 94, 22-23. DOI: 10.1016/j.pep.2013.10.016
Chen, Rachel. Bacterial expression systems for recombinant protein production. E.coli and beyond. Biotechnology Advances. 2012, 30(5), 1102-1107. DOI: 10.1016/biotechadv.2011.09.013
Seznam doporučené literatury
Klouda, Pavel: Moderní analytické metody. 2., upr. a dopl. vyd. Ostrava. Pavel Klouda, 2003, ISBN 80-86369-07-2
Hortsch, Ralf a Dirk Weuster-Botz. Growth and recombinant protein expression with Escherichia coli in different batch cultivation media. Applied Microbiology and Biotechnology. 2011, 90(1)m 69-76. DOI:10.1007/s00253-0103036-V
Papaneophytou, Christos P. a George Kontopidis. Statistical sppiroaches to maximize recombinant, protein expression in Escherichia coli. A general review. Protein Expression and Purification.
2014, 94, 22-23. DOI: 10.1016/j.pep.2013.10.016
Chen, Rachel. Bacterial expression systems for recombinant protein production. E.coli and beyond. Biotechnology Advances. 2012, 30(5), 1102-1107. DOI: 10.1016/biotechadv.2011.09.013