Obsah přednášky: 1. Základy hmotnostní spektrometrie (základní terminologie, jednotky, fyzikální konstanty). Principy ionizace látek a disociace iontů (ionizace v plynné fázi energetickými elektrony), tvorba iontů, stabilní, metastabilní a nestabilní ionty. 2. Praktické aspekty elektronové ionizace. Izotopické složení a přesná hmotnost látek (mono - izotopické, di- izotopické a poly- izotopické prvky, výpočet distribuce izotopů). Přesná hmotnost a složení molekul (hmotnostní defekt, přesnost a spolehlivost dat). Aplikace vysoce rozlišující hmotnostní spektrometrie. 3. Instrumentace (kvadrupól, lineární a 3D iontová past, přístroje s magnetickým sektorem, průletové analyzátory, FT iontová cyklotronová rezonance, orbitrap, detektory). 4. Další způsoby ionizace (chemická ionizace, ionizace polem), tandemová hmotnostní spektrometrie, FAB, MALDI, ambientní MS (ESI, APCI, APPI), DESI, DART. Metabolomika na bázi hmotnostní spektrometrie, metabolomické databáze. 5. Magnetické momenty jader, jádra využívaná v NMR spektroskopii proteinů a nukleových kyselin, isotopové značení. NMR spektrometr, statické homognenní magnetické pole, radiofrekvenční pulzy, rezonanční frekvence, excitace, magnetizace, polarizace, koherence. Interakce magnetických momentů s molekulovým okolím, dipól-dipólové inetrakce s okolními jádry a nukleární Overhauserův efekt (NOE), stínění elektrony a chemický posun, interakce s okolními jádry zprostředkované elektrony vazeb (skalární interakce). Základní experiment NMR, Fourierova transformace. 6. Strategie studia proteinů a nukleových kyselin pomocí NMR. Vícerozměrná spektroskopie, homonukleární a heteronukleární korelace, 3D experimenty pro přiřazení rezonančních frekvencí jádrům páteře proteinů, přiřazení postranních řetězců, přiřazení rekvencí jádrům nukleových kyselin. 7. NMR experimenty poskytující informace o struktuře, vzdálenosti atomů z NOE, experiment NOESY, torzní úhly z trojvazebných skalárních interakčních konstant, orientace molekulových fragmentů ze zbytkových dipólových interakcí, částečně orientované vzorky, určení sekundárních struktur, výpočet strukturních modelů z NMR dat. 8. Dynamika proteinů a nukleových kyselin, NMR relaxace, korelační funkce, funkce spektrální hustoty. Rotační difúze, rychlé vnitřní pohyby, parametr uspořádání, korelační časy, konformační a chemická výměna, experimenty pro popis molekulových pohybů a interakcí mezi molekulami. 9. Fyzikální principy elektronové mikroskopie, fyzikální vlastnosti urychlených elektronů, rozlišení, zvětšení, Transmisní elektronový mikroskop 10. Příprava preparátů pro TEM fyzikálními a chemickými metodami 11. Skenovací elektronová mikroskopie a příprava preparátů pro SEM 12. Elektromikroskopická cytologie Obsah cvičení: 1. Analýza základního NMR experimentu, vyhodnocení simulovaného NMR spektra, Fourierova transformace 2. Přiřazení frekvencí jádrům páteře peptidu na základě simulovaných 3D spekter, sekvenční přiřazení fragmentu DNA na základě simulovaných NOESY spekter. 3. Určení sekundární struktury proteinu na základě NMR dat. Vyhodnocení relaxačních dat, určení parametrů popisujících pohyby molekul.
|
-
Jürgen H. Gross: Mass Spectrometry. A textbook, Second Edition, Springer Verlag Berlin, Heidelberg 2011.
-
Lakowicz J.R.: Principles of fluorescence spectroscopy, 3rd edition, Springer, 2006.
-
Prosser V., ed.: Experimentální metody biofyziky, Academia, 1989.
-
Selvin P.R., Ha T.: Single-molecule techniques, CSH Press, New York, 2008.
-
van Holde K.E., Johnson W.C., Ho P.S.: Principles of Physical Biochemistry, 2nd edition, Prentice Hall, Upper Saddle River, NJ, 2005.
|